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<title>Plasmidpräparation</title>

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<h1 id="firstHeading" class="firstHeading mw-first-heading"><span class="mw-page-title-main">Plasmidpräparation</span></h1>

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<div id="mw-content-text" class="mw-body-content mw-content-ltr" lang="de" dir="ltr"><div class="mw-content-ltr mw-parser-output" lang="de" dir="ltr"><p>Die <b>Plasmidpräparation</b> (auch <i>Plasmidisolierung</i>) ist eine <a href="Molekularbiologie" title="Molekularbiologie">molekularbiologische</a> Methode zur Isolierung von <a href="Plasmid" title="Plasmid">Plasmid</a>-<a href="Desoxyribonukleins%C3%A4ure" title="Desoxyribonukleinsäure">DNA</a> aus Bakterien.<sup id="cite_ref-1" class="reference"><a href="#cite_note-1"><span class="cite-bracket">[</span>1<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Die Plasmidpräparation ist eine Variante der <a href="DNA-Extraktion" title="DNA-Extraktion">DNA-Extraktion</a>.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Anwendung">Anwendung</h2></div>

<p>Die Verwendung von <a href="Plasmid" title="Plasmid">Plasmiden</a> erlaubt es, genetisches Material in <a href="Bakterien" title="Bakterien">Bakterien</a> zu vervielfältigen oder bestimmte Gene in andere Organismen zu übertragen. Die <a href="Ausbeute_(Chemie)" title="Ausbeute (Chemie)">Ausbeute</a> an Plasmiden hängt unter anderem vom Bakterienstamm, dem verwendeten <a href="Kulturmedium" class="mw-redirect" title="Kulturmedium">Kulturmedium</a>, dem <a href="Replikationsursprung" title="Replikationsursprung">Replikationsursprung</a> des Plasmids (sog. <i><span lang="en">high copy plasmids</span></i> oder <i><span lang="en">low copy plasmids</span></i>) und den Kulturbedingungen ab (<a href="Sch%C3%BCttelmaschine_(Labor)" title="Schüttelmaschine (Labor)">Schüttler</a> bis zu 200 Rotationen pro Minute, Form der Kulturflasche wie z. B. Schikanenkolben, Temperatur). Zur Isolierung kleiner Mengen an Plasmiden (bis 25 µg) steht die Minipräp zur Verfügung, für größere Mengen bis 0,5 mg eignet sich die Maxipräp, darüber bis 2 mg die Megaprep und bis 10 mg die Gigaprep. Die Plasmidpräparation wird verwendet, um Plasmide aus <a href="Transformation_(Genetik)" title="Transformation (Genetik)">transformierten</a> Bakterien, zumeist <i><a href="Escherichia_coli" title="Escherichia coli">Escherichia coli</a></i>, präparativ zu isolieren.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Alkalische_Lyse">Alkalische Lyse</h2></div>

<div class="hauptartikel" role="navigation"><span class="hauptartikel-pfeil" title="siehe" aria-hidden="true" role="presentation">→ </span><i><span class="hauptartikel-text">Hauptartikel</span>: <a href="DNA-Extraktion" title="DNA-Extraktion">DNA-Extraktion</a></i></div>

<p>Es gibt mehrere Möglichkeiten zur Plasmidpräparation, eine häufig verwendete ist die <b>alkalische Lyse</b>.<sup id="cite_ref-2" class="reference"><a href="#cite_note-2"><span class="cite-bracket">[</span>2<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Die Bakterien mit dem Plasmid werden mit ca. 5000 x g <a href="Zentrifuge" title="Zentrifuge">zentrifugiert</a> und das <a href="Pellet" title="Pellet">Pellet</a> anschließend in einem <a href="Pufferl%C3%B6sung" class="mw-redirect" title="Pufferlösung">Puffer</a> resuspendiert. Zur Degradation störender <a href="Ribonukleins%C3%A4ure" title="Ribonukleinsäure">RNA</a> enthält die Lösung meist zusätzlich eine <a href="Rnase" class="mw-redirect" title="Rnase">RNase</a>. Durch Zugabe einer Lösung von <a href="Natriumdodecylsulfat" class="mw-redirect" title="Natriumdodecylsulfat">SDS</a> und <a href="Natriumhydroxid" title="Natriumhydroxid">Natriumhydroxid</a> werden die Zellen durch das <a href="Detergens" title="Detergens">Detergens</a> und die alkalische <a href="Verseifung" title="Verseifung">Verseifung</a> der <a href="Lipide" title="Lipide">Lipide</a> <a href="Lyse_(Biologie)" title="Lyse (Biologie)">lysiert</a>.

</p><p>Durch die Zugabe von NaOH zum Zellextrakt wird der pH-Wert weit ins Alkalische verschoben. Dadurch lösen sich die Wasserstoff-Brückenbindungen zwischen den komplementären DNA-Strängen sowohl der chromosomalen als auch der Plasmid-DNA, wobei die Plasmid-DNA aufgrund ihrer Konformation in der Lage ist, vollständig zu renaturieren. Die chromosomale DNA, die durch die einzelnen Präparationsschritte zerstückelt wurde, kann nach Neutralisation des pH-Wertes mit Kaliumacetat und Eisessig nicht renaturieren, es bilden sich DNA-Doppelstränge mit nur kurzen komplementären Bereichen und durch die ungerichtete Verbindung vieler DNA-Einzelstränge kommt es zur Ausbildung einer verworrenen DNA-Masse. Diese kann relativ leicht abzentrifugiert werden. Bei diesem Zentrifugationsschritt setzen sich ferner Zellmembran- und Zellwandbestandteile sowie Proteine als Pellet ab. Die Plasmid-DNA befindet sich nach der Zentrifugation im Überstand.

</p><p>Die gelöste <a href="Plasmid" title="Plasmid">Plasmid-DNA</a> kann einer zusätzlichen Reinigung unterzogen werden z. B. einer <a href="Phenol-Chloroform-Extraktion" title="Phenol-Chloroform-Extraktion">Phenol-Chloroform-Extraktion</a> oder einer <a href="Adsorption" title="Adsorption">Adsorption</a> an <a href="DNA-Extraktion" title="DNA-Extraktion">Silicagel</a>.<sup id="cite_ref-3" class="reference"><a href="#cite_note-3"><span class="cite-bracket">[</span>3<span class="cite-bracket">]</span></a></sup><sup id="cite_ref-4" class="reference"><a href="#cite_note-4"><span class="cite-bracket">[</span>4<span class="cite-bracket">]</span></a></sup><sup id="cite_ref-5" class="reference"><a href="#cite_note-5"><span class="cite-bracket">[</span>5<span class="cite-bracket">]</span></a></sup> Die DNA kann dann mit einem Alkohol wie <a href="Ethanol" title="Ethanol">Ethanol</a> oder <a href="Isopropanol" class="mw-redirect" title="Isopropanol">Isopropanol</a> ausgefällt werden. Der Alkohol entzieht der DNA die <a href="Hydrath%C3%BClle" class="mw-redirect" title="Hydrathülle">Hydrathülle</a>. Mit 70 % Ethanol wird die gefällte DNA dann gewaschen und steht dann zur weiteren Verarbeitung zur Verfügung. Zur Vermessung der Konzentration im <a href="Photometer" title="Photometer">Photometer</a> kann die DNA zum Beispiel in <a href="Wasser" title="Wasser">Wasser</a> oder <a href="TE-Puffer" title="TE-Puffer">TE-Puffer</a> (pH 7,5) wieder gelöst werden.

</p>

<p>Eine andere Aufschlussmethode stellt z. B. die sogenannte „<b>Koch-Lyse</b>“ dar. Dabei werden die bakteriellen Zellwände im Zuge eines <a href="Zellaufschluss" title="Zellaufschluss">Zellaufschlusses</a> durch Zugabe von <a href="Lysozym" title="Lysozym">Lysozym</a> zerstört und die lysierten Bakterien für kurze Zeit aufgekocht, bzw. in einem Heizblock bei 95 °C erhitzt. Die chromosomale DNA und die denaturierten Proteine werden abzentrifugiert. Die Plasmid-DNA kann vor der Präzipitation noch mittels Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt werden. Die in Wasser oder TE-Puffer gelöste DNA enthält noch RNA, weshalb eine photometrische Quantifizierung nicht sinnvoll ist. Schließt sich eine <a href="Gelelektrophorese" title="Gelelektrophorese">Gelanalyse</a> an, wird der Probenpuffer mit RNase A versetzt.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Alternative_Verfahren">Alternative Verfahren</h2></div>

<div class="hauptartikel" role="navigation"><span class="hauptartikel-pfeil" title="siehe" aria-hidden="true" role="presentation">→ </span><i><span class="hauptartikel-text">Hauptartikel</span>: <a href="DNA-Reinigung" title="DNA-Reinigung">DNA-Reinigung</a></i></div>

<p>Weitere, generelle DNA-Reinigungsmethoden sind z. B. die <a href="Caesiumchlorid" title="Caesiumchlorid">CsCl</a>-<a href="Dichtegradientenzentrifugation" title="Dichtegradientenzentrifugation">Dichtegradientenzentrifugation</a>.

</p>

<div class="mw-heading mw-heading2"><h2 id="Belege">Belege</h2></div>

<li id="cite_note-1"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-1">↑</a></span> <span class="reference-text"><span class="cite"><a rel="nofollow" class="external text" href="https://www.hoelzel-biotech.com/de/anwendungs-infothek/plasmidpraeparation-info.html"><i>Plasmidpräparation - Info - Anwendungs Infothek - Ressourcen.</i></a><span class="Abrufdatum"> Abgerufen am 27. Juli 2023</span>.</span><span style="display: none;" class="Z3988" title="ctx_ver=Z39.88-2004&rft_val_fmt=info%3Aofi%2Ffmt%3Akev%3Amtx%3Adc&rfr_id=info%3Asid%2Fde.wikipedia.org%3APlasmidpr%C3%A4paration&rft.title=Plasmidpr%C3%A4paration+-+Info+-+Anwendungs+Infothek+-+Ressourcen&rft.description=Plasmidpr%C3%A4paration+-+Info+-+Anwendungs+Infothek+-+Ressourcen&rft.identifier=https%3A%2F%2Fwww.hoelzel-biotech.com%2Fde%2Fanwendungs-infothek%2Fplasmidpraeparation-info.html"> </span></span>

</li>

<li id="cite_note-2"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-2">↑</a></span> <span class="reference-text">H. C. Birnboim, J. Doly: <i>A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA.</i> In: <i>Nucleic Acids Res.</i> (1979), Band 7(6), S. 1513–1523. <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/388356?dopt=Abstract">PMID 388356</a>; <a rel="nofollow" class="external text" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC342324/">PMC 342324</a> (freier Volltext).</span>

</li>

<li id="cite_note-3"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-3">↑</a></span> <span class="reference-text">M. A. Marko, R. Chipperfield, H. C. Birnboim: <i>A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder.</i> In: <i>Anal Biochem.</i> (1982), Band 121(2), S. 382–387. <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6179438?dopt=Abstract">PMID 6179438</a>.</span>

</li>

<li id="cite_note-4"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-4">↑</a></span> <span class="reference-text">R. Boom, C. J. Sol, M. M. Salimans, C. L. Jansen, P. M. Wertheim-van Dillen, J. van der Noordaa: <i>Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</i> In: <i>J Clin Microbiol.</i> (1990), Band 28(3), S. 495–503. <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1691208?dopt=Abstract">PMID 1691208</a>; <a rel="nofollow" class="external text" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC269651/">PMC 269651</a> (freier Volltext).</span>

</li>

<li id="cite_note-5"><span class="mw-cite-backlink"><a href="#cite_ref-5">↑</a></span> <span class="reference-text">T. A. Borodina, <a href="Hans_Lehrach" title="Hans Lehrach">H. Lehrach</a>, A. V. Soldatov: <i>DNA purification on homemade silica spin-columns.</i> In: <i>Anal Biochem.</i> (2003), Band 321(1), S. 135–137. <a class="external mw-magiclink-pmid" rel="nofollow" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12963065?dopt=Abstract">PMID 12963065</a>.</span>

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